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大腸菌群平板計數(shù)法

 本法參照國標GB 4789. 3-2010規(guī)定的大腸菌群測定方法第二法。

⒈檢驗程序見圖3-7
 
⒉原理

樣品先經(jīng)過VRBA瓊脂平板的篩選,因其中含有膽鹽和結晶紫,可以很好的抑制革蘭氏陽性菌的生長,乳糖可以產(chǎn)酸,在中性紅存在時,產(chǎn)生典型的紫紅色周圍有紅色膽鹽沉淀的菌落。因為其他陰性腸桿菌可以分解其他糖類產(chǎn)生紅色菌落,因此需接種BGLB培養(yǎng)基證實。

⒊操作步驟

樣品處理及稀釋同MPN法。

①加樣制作平板:選取2-3個適宜的連續(xù)稀釋度,每個稀釋度接種2個無菌平皿,每皿ImL。同時取1mL生理鹽水加入無菌平皿作空白對照。及時將15 -20mL冷至46℃的結晶紫中性紅膽鹽瓊脂(VRBA)傾注.于每個平皿中。小心旋轉平皿,將培養(yǎng)基與樣液充分混勻,待瓊脂凝固后,再加3~ 4mL VRBA覆蓋平板表層。翻轉平板,置于(36±1)0C培養(yǎng)18~24h.

②平板菌落數(shù)的選擇:選取菌落數(shù)在15 ~150CFU的平板,分別計數(shù)平板上出現(xiàn)的典型和可疑大腸菌群菌落。典型菌落為紫紅色,菌落周圍有紅色的膽鹽沉淀環(huán),菌落直徑為0. 5mm或更大。

③證實試驗:從VRBA平板上挑取10個不同類型的典型和可疑菌落,分別移種于BGLB肉湯管內(nèi),(36±1)℃培養(yǎng)24-48h,觀察產(chǎn)氣情況。凡BGLB肉湯管產(chǎn)氣,即可報告為大腸菌群陽性。

④大腸菌群平板計數(shù)的報告:經(jīng)最后證實為大腸菌群陽性的試管比例乘以8. 3中計數(shù)的平板菌落數(shù),再乘以稀釋倍數(shù),即為每克(每毫升)樣品中大腸菌群數(shù)。例:10-4樣品稀釋液1mL,在VRBA平板上有100個典型和可疑菌落,挑取其中10個接種BGLB肉湯管,證實有6個陽性管,則該樣品的大腸菌群數(shù)為:100 X 6/10 X 10-4 CFU/g(mL)=6. 0 X 10一3 CFU/g(mL)。

⒋檢驗時應注意的事項

①檢驗步驟

2008版前的大腸菌群的檢驗步驟采用三步法(乳糖膽鹽發(fā)酵試驗、EMB瓊脂分離培養(yǎng)和證實試驗)。第一步乳糖發(fā)酵實驗是樣品的發(fā)酵結果,不是純菌的發(fā)酵試驗,所以初發(fā)酵陽性管,經(jīng)過平板分離和證實試驗后,有時可以成為陰性。大量的數(shù)據(jù)表明,食品中大腸菌群檢驗步序的符合率,初發(fā)酵與證實試驗相差較大,不同食品三步法的符合情況也不一致,所以2008版之后改為兩步法,取消了分離培養(yǎng)這一步,將大腸菌群MPN計數(shù)法的培養(yǎng)基由乳糖膽鹽修改為月桂基硫酸鹽胰蛋白膝肉湯;復發(fā)酵培養(yǎng)基由乳糖發(fā)酵肉湯改為亮綠乳糖膽鹽(BGLB)肉湯,大腸菌群MPN法中報告每100mL (100g)改為1mL(1g)。試驗證實,修改后對大腸菌群的檢出效果相同,發(fā)酵管對于陽性結果的判斷只通過“產(chǎn)氣”,不存在顏色的影響,明確了判斷依據(jù);減少了步驟,使操作更加簡便,結果更接近真實。

②產(chǎn)酸產(chǎn)氣原因:在初發(fā)酵試驗中,能出現(xiàn)產(chǎn)酸產(chǎn)氣現(xiàn)象的原因很多,如大腸菌群發(fā)酵乳糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣;兩種細菌共同作用發(fā)酵乳糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣,但其中任何一種不能單獨發(fā)酵;食品中雜菌多時,(多黏芽抱桿菌、浸麻芽抱桿菌、產(chǎn)氣莢膜梭菌)發(fā)酵乳糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣;有些非大腸菌群發(fā)酵葡萄糖等糖類產(chǎn)酸產(chǎn)氣。因此必須做證實試驗。

③復發(fā)酵結果:從LST產(chǎn)氣管接一環(huán)到BGLB中進行復發(fā)酵,(此時不受樣品中非乳糖的干擾進行乳糖發(fā)酵,也避免了許多芽抱桿菌的干擾),在BGLB中產(chǎn)氣的為陽性,不產(chǎn)氣的為陰性。但此法也有缺陷,有時出現(xiàn)假陽性。由于亮綠遇膽鹽降低了其活性,有時不能徹底抑制芽抱菌。為避免此缺陷,對BGLB中產(chǎn)氣的劃線于EMB上,挑典型菌落鏡檢。

④抑菌劑:在大腸菌群檢驗中,經(jīng)常使用的抑菌劑有膽鹽、洗衣粉、十二烷基磺酸鈉、亮綠、結晶紫、孔雀綠等。抑菌劑雖可抑制樣品中的一些雜菌,而有利于大腸菌群的生長和挑選,但對大腸菌群中的某些菌株有時也產(chǎn)生一些抑制作用。有些抑菌劑用量甚微,稱量時稍有誤差,即可對抑菌作用產(chǎn)生影響;有的抑菌劑當牌號、規(guī)格改變時,也可影響抑菌效果,而需重新測定抑菌的有效劑量,這些情況均給抑菌劑的使用帶來不利條件。目前我國在食品大腸菌群檢驗方面采用膽鹽作為抑菌劑,豬、牛、羊三種膽鹽對大腸菌群的檢驗效果,經(jīng)試驗觀察無明顯差異,可相互替代,但其他膽鹽的檢驗效果則不一致,故不宜相互替代。

目前由于膽鹽不易購買,有的實驗室以3號膽鹽、混合膽鹽、去氧膽酸鈉、兔膽鹽等替代豬膽鹽加入培養(yǎng)基中,這會影響大腸菌群的檢驗結果,應予注意。因此在2008版的檢驗標準中改為月桂基硫酸鈉。兩者的作用都是抑制革蘭氏陽性球菌。但前者是化學試劑,批間差異小,易觀察結果,對損傷菌有修復作用,檢出率提高,檢驗結果穩(wěn)定。后者是生物試劑,取自牛和豬等動物的膽囊,批間差異大,結果可靠性差。另外,在膽鹽用量上實驗表明1%, 0.5%和0. 25%三個劑量無任何差異,所以目前乳糖發(fā)酵管采用的膽鹽劑量((0. 5%)是適宜的,在稱量時稍有誤差,亦不致影響大腸菌群的檢出。

⑤平板計數(shù)法:若樣品較臟,使用MPN法較不方便,一般使用結晶紫中性紅膽鹽瓊脂(VRBA)在平皿內(nèi)樣品稀釋液與VRBA瓊脂混合,等到凝固后,另加蓋一層VRBA瓊脂,以抑制專性需氧菌,從中挑取粉紅暈的菌落計數(shù),取30~150個菌落的平板,挑選其中10個有代表性的菌落分別接種到亮綠膽鹽發(fā)酵管進行鑒定。

⑥挑選菌落:大腸菌群是一群腸道桿菌的總稱,大腸菌群菌落的色澤、形態(tài)等方面較大腸埃希氏菌類更為復雜和多樣,而且與大腸菌群的檢出率密切相關。所以在實際工作中,為了提高大腸菌群的檢出率,應當熟悉大腸菌群的菌落色澤和形態(tài)。在檢驗中,大腸菌群在VRBA瓊脂上典型菌落呈紫紅色,菌落周圍有紅色的膽鹽沉淀環(huán),菌落直徑為0. 5mm或更大。在伊紅一美藍(EMB)平板上的菌落呈黑紫色有光澤或無光澤的檢出率最高;紅色、粉紅色菌落檢出率較低。菌落形態(tài)的其他方面(如菌落大小、光滑與粗糙、邊緣完整情況、降起度、濕潤與干燥等)雖亦應注意,但不如色澤方面更為重要。影響大腸菌群檢出率的因素較多,如食品種類、菌落色擇和形態(tài)、細菌種類等,所以實際工作中通常挑選一個菌落,由于概率問題,難免出現(xiàn)假陰性,尤其當菌落不典型時。所以挑菌落一定要挑取典型菌落,如無典型菌落則多挑幾個,以免出假陰性。

⑦產(chǎn)氣量:大腸菌群的產(chǎn)氣量,多者可使發(fā)酵倒管全部充滿氣體,少者可以產(chǎn)生小于米粒的氣泡。一般來說,產(chǎn)氣量與大腸菌群檢出率呈正相關,但隨樣品種類而不同,有小于米粒的氣泡,亦可有陽性檢出。對未產(chǎn)氣的乳糖發(fā)酵管如有疑問時,可用手輕輕打動試管,如有氣泡沿管壁上浮,即應考慮可能有氣體產(chǎn)生,而應做進一步觀察。這種情況的陽性檢出率可達半數(shù)以上。
⑧MPN法:MPN法是一種采用數(shù)學理論推算,用置信區(qū)間描述細菌濃度的一種間接計數(shù)法。雖然實驗結果以MPN值表示,但MPN值并不能表示實際菌落數(shù),而實際菌落數(shù)落在置信區(qū)間內(nèi)的任何一點。該方法是1915年McCrady首次發(fā)表的。

最可能數(shù)(MPN)是表示樣品中活菌密度的估測。MPN檢索表通常是采用三個稀釋度九管法來計算的,當然也可以十五管或更多。稀釋度的選擇是基于對樣品中菌數(shù)的估測,較理想的結果應是最低稀釋度3管為陽性,而最高稀釋度的3管為陰性。如果無法估測樣品中的菌數(shù),則做一定范圍的稀釋度。這次提供的MPN檢索表列出了95%可信限,供作參考。

另外,在查閱MPN檢索表時,應注意以下幾不問題。

通常MPN檢索表只給了三個稀釋度,即0.1mL(g), 0.O1mL(g), 0.OO1mL(g),如欲改用1mL(g)、0. 1mL(g)、0. 01mL(g)或0. 01mL(g)、0. 001mL(g)、0. 0001mL(g)時,則表內(nèi)數(shù)字應相應增加或降低10倍,其余可類推。

在MPN檢索表第一欄陽性管數(shù)下面列出的mL (g),系指原樣品(包括液體和固體)的毫升(克)數(shù),并非樣品稀釋后的毫升(克)數(shù),如固體樣品lg經(jīng)10倍稀釋后,雖加人1mL量,但實際其中只含0. 1 g樣品,故應按0. 1g計,不應按1mL計,或按1mL計,單檢索數(shù)字必須再乘以稀釋倍數(shù)。

當檢索表內(nèi)三個稀釋度檢測結果都是陰性時,MPN值應按<3判定,這樣更能反映實際情況。例如11. 1mL(g)和1. 11mL(g)兩個檢測劑量,當它們都是陰性時,如按。處理,則兩組樣品雖相差10倍,但MPN值卻無法區(qū)分,實際上這兩個。的含義并不相等。如按照<3和<30處理,則MPN值能反映出兩組所用樣品量的不同,實際上11. 1mL(g)應為G3,而1. 11mL(g)應為<30,二者還是有區(qū)別的。所以用<3和<30處理,更能反映實際情況。

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